19世紀(jì)末，人們發(fā)現(xiàn)使用相應(yīng)抗原免疫動物后，獲得含有多克隆抗體的動物抗血清可以用于治療早期的肺炎、白喉、麻疹等傳染病，從而開啟了抗體在醫(yī)學(xué)中的治療時代。1975年雜交瘤技術(shù)的問世，使抗體技術(shù)發(fā)展進(jìn)入單克隆抗體的新時代，但鼠源單克隆抗體會產(chǎn)生人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody，HAMA)反應(yīng)，限制了其在臨床上的應(yīng)用。20世紀(jì)70年代，日本醫(yī)學(xué)家利根川進(jìn)在基因水平探討了抗體的多樣性形成機(jī)制，證實(shí)了Ig基因結(jié)構(gòu)，獲得1987年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。之后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開始對抗體進(jìn)行改造，先后出現(xiàn)了嵌合抗體和人源化抗體，很大程度上解決了鼠抗HAMA反應(yīng)的問題。20世紀(jì)90年代以后，隨著PCR技術(shù)、抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，治療性單抗得以實(shí)現(xiàn)全人源化改造，目前在臨床上，尤其是在腫瘤、自身免疫性疾病和感染類疾病的治療方面得以廣泛應(yīng)用。本節(jié)將主要探討抗腫瘤單克隆抗體的開發(fā)和制備策略。

基于動物免疫的抗體制備策略

雜交瘤抗體技術(shù)

1975年德國醫(yī)學(xué)家Kohler和英國醫(yī)學(xué)家Milstein開展了一項(xiàng)具有劃時代意義的新技術(shù)，他們首次在體外通過將綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，成功獲得了雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過篩選擴(kuò)大培養(yǎng)后這種雜交瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生只針對某一特定的抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。這種通過將能無限大量繁殖的腫瘤細(xì)胞與能產(chǎn)生抗體的 B細(xì)胞融合，以產(chǎn)生既能無限增殖又能產(chǎn)生特異性抗體的技術(shù)稱為雜交瘤技術(shù)。

雜交瘤技術(shù)的主要流程可以概括為：①將免疫動物的脾細(xì)胞和無限增殖的瘤細(xì)胞融合以得到雜交瘤細(xì)胞;②以分泌目標(biāo)抗體為限制條件，篩選得到的雜交瘤細(xì)胞：③擴(kuò)大培養(yǎng)分泌目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞，使之單克隆化;④運(yùn)用體外培養(yǎng)或體內(nèi)誘導(dǎo)法，分離提純以獲得大量的目標(biāo)單克隆抗體(圖6-1)。

傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)具有生產(chǎn)成本較低、可持續(xù)性生產(chǎn)、操作性較好等優(yōu)點(diǎn)，目前仍然是制備單克隆抗體的主要方法之一。通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克降抗體具有純度高、效價高、特異性好的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、臨床診斷和治療中。但雜交瘤技術(shù)也存在一些問題：①是否有合適的骨髄瘤細(xì)胞系決定能否有目標(biāo)克隆抗體產(chǎn)生;②融合形成的雜交瘤細(xì)胞也可能低產(chǎn)導(dǎo)致難以分離培養(yǎng);③因基因不穩(wěn)定性導(dǎo)致一些難以預(yù)料的問題：④因鼠源性抗體的免疫原性，產(chǎn)生HAMA反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體免疫損傷⑤不能有效激活補(bǔ)體系統(tǒng)且在體內(nèi)的半衰期較短而起不到良好的免疫效應(yīng)作用。

人源化抗體

由于單克隆抗體大多數(shù)是鼠源性的，在人體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗鼠抗體，產(chǎn)生HAMA 反應(yīng)，限制單克隆抗體在臨床中的應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展及對各類抗體結(jié)構(gòu)、功能和編碼基因認(rèn)識的深入，可通過將異源抗體中與抗原結(jié)合的相關(guān)氨基酸結(jié)構(gòu)與人抗體相互組合拼接構(gòu)成經(jīng)人源化改造的抗體，以減輕異源性抗體的免疫副作用。

目前對Ig分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)有較清楚的認(rèn)識，Ig分子的基本結(jié)構(gòu)是一“Y”字形的四肽鏈結(jié)構(gòu)，由兩條相同的重鏈(heavy chain, H)和兩條相同的輕鏈(light chain, L)借助二硫鍵連接起來。其中在多肽鏈的N端，占輕鏈的1/2,重鏈的1/4的氨基酸序列隨抗體的不同而有所變化，稱為可變區(qū)(variable region，VR)，重鏈和輕鏈的V區(qū)分別稱為VH 和VL,各有三個氨基酸排列順序高度可變的區(qū)域，稱為高變區(qū)(hypervariable region, HVR), 高變區(qū)是抗原與抗體特異性結(jié)合的位點(diǎn)，其與抗原表位在空間結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)，又稱為互補(bǔ)決定簇(complementarity determining region，CDR)。可變區(qū)中的四個非髙變區(qū)部位氣基酸 排列較為固定，形成骨架結(jié)構(gòu)夾持著CDR，故稱為骨架區(qū)(frame work region, FR)。恒 定區(qū)(constant region，CR)在多肽鏈的C端，占輕鏈的1/2,重鏈的3/4,其氨基酸數(shù)量、 種類、排列順序均較穩(wěn)定，不同Ig分子的CH長度不一，可以為CH1-3或CH1-4。

對于鼠源性的單克隆抗體的人源化改造研究過程可以分為2個主要的發(fā)展階段: ①將鼠源性單克隆抗體的VR和人源性抗體的CR相互組合，形成嵌合抗體：②僅僅保留鼠源性單克隆抗體VR中與抗原結(jié)合的CDR，而將FR、CR均改為人源抗體的組成結(jié)構(gòu)， 制備形成的抗體稱為CDR移植抗體或稱改型抗體(圖6-2)。

嵌合抗體

嵌合抗體合成的基本原理為：通過利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞表達(dá)出嵌合抗體，這樣表達(dá)的抗體分子中輕重鏈的V 區(qū)是異源的，而C 區(qū)是人源的，整個抗體分的近2/3部分都 是人源的。通過這樣的技術(shù)合成的抗體，減少了異源性抗體的免疫原性，同時保留了親抗體特異性結(jié)合抗原的能力。目前嵌合抗體主一有三種應(yīng)用形式：嵌合IgG抗體、嵌合Fab抗體、嵌合F(ab')2抗體。嵌合IgG抗體含有人抗體的Fc段能有效的介導(dǎo)細(xì)胞免疫治療以及激活補(bǔ)體系統(tǒng)，但鼠源性成分較多，免疫原性大且不易穿透組織，后兩種抗體分子量小、穿透力強(qiáng)，但因不具有人抗體的Fc段而不能直接通過細(xì)胞毒作用發(fā)揮生物活性，可作為小分子藥物載體或用于診斷試驗(yàn)。

改型抗體

改型抗體又稱CDR移植抗體，是指抗體的恒定區(qū)部分(即CH和CL區(qū))或抗體的全部構(gòu)成均由人類抗體基因所編碼而產(chǎn)生的抗體，可以明顯減少異源抗體因其免疫原性對人類機(jī)體造成的免疫副作用。抗體可變區(qū)的CDR直接決定抗體的特異性，是抗體識別和結(jié)合抗原的區(qū)域。用鼠源性單抗的CDR移植到人源性抗體的可變區(qū)替換人源性抗體CDR, 使人源性抗體獲得鼠源性單抗的抗原結(jié)合特異性，合成的重組抗體稱為改型抗體，可分為完全CDR移植抗體、部分CDR移植抗體、特異決定區(qū)移植抗體三種類型。完全CDR移 植抗體是指將鼠源性單抗的CDR區(qū)完全移植到人源性抗體中形成的移植抗體;部分CDR 移植抗體是指由于并不是所有CDR均為抗原抗體特異性結(jié)合所必需的，將抗原抗體結(jié)合所必需的CDR移植到人源性抗體上以實(shí)現(xiàn)減小免疫原性的抗體;特異決定區(qū)移植抗體是指將一個CDR中參與抗原識別的特異蛋白分子構(gòu)成的特異決定區(qū)移植替換人源性抗體中相應(yīng)區(qū)域后形成的抗體，其免疫原性有很大程度的降低。然而，雖然抗原與抗體的特異性結(jié)合主要與CDR相關(guān)，夾持著CDR的支架結(jié)構(gòu)骨架區(qū)也可以通過影響CDR的空間構(gòu)型 來發(fā)揮.定的作用，因此重組抗體中鼠源CDR和人源骨架區(qū)相嵌的結(jié)構(gòu)可能會導(dǎo)致抗原原有CDR構(gòu)型的改變，從而導(dǎo)致結(jié)合抗原的能力下降。

全人抗體

全人抗體是目前治療性抗體的主要開發(fā)趨勢，目前生產(chǎn)全人抗體的技術(shù)已達(dá)到比較成熟的階段，主耍包括抗體庫技術(shù)和基因工程小鼠技術(shù)。具體而言，全人抗體是指通過噬菌體展示庫技術(shù)、核糖體展示庫技術(shù)等抗體庫技術(shù)，或者通過將編碼人類抗體的全部基因通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)轉(zhuǎn)移至經(jīng)過基因工程改造的抗體基因缺失的動物中而表達(dá)出人類抗體，來達(dá)到抗體全人源化的目的。全人抗體可大幅度地消除異源抗體或部分人源化抗體的免疫原性，避免通過激的免疫副作用，增加抗體應(yīng)用的安全性，目前已應(yīng)用于診斷、檢測和臨床治療當(dāng)中，但也面臨著一些問題，如制備工藝要求較高、不同單抗經(jīng)過人源化以后悔出現(xiàn)不同程度的與抗原結(jié)合能力的下降，一般而言人源化抗體的結(jié)合力為原本的33%~50%，在長期、大量、重復(fù)應(yīng)用人源化單抗時，仍然可能會出現(xiàn)HAMA反應(yīng)。