T細(xì)胞在體內(nèi)持久性

臨床試驗中檢測T細(xì)胞在體內(nèi)存活時間的方法主要有反轉(zhuǎn)錄PCR法TCR基因掃描、 MHC-肽四聚體染色法、實時熒光定量PCR和流式細(xì)胞分析技術(shù)。

同一克降T細(xì)胞重排后其互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)的長度和序列完全相同，而不同克隆T細(xì)胞有所不同，因此分析TCR CDR3的長度和序列，可以作為判別t細(xì)胞克降性的指標(biāo)，通過分析TCRVβ亞家族的分布及克隆特點，可對特定克隆亞群細(xì)胞進(jìn)行分析;T細(xì)胞通過特異性TCR識別由MHC分子提呈的抗原肽，因此可用熒光標(biāo)記的MHC-肽復(fù)合物檢測抗原特異性T細(xì)胞。Altman等首次發(fā)明此方法并應(yīng)用于檢測可識別HIV抗原肽的特異性CTL，獲得成功。該方法具有迅速、直接、靈敏且特異性強(qiáng)的優(yōu)點，比傳統(tǒng) CTL有限稀釋法敏感性高10100倍;實時熒光定量pCr是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法，基于引物和探針的靶向和放大CAR-T或TCR-T的編碼DNA，通過與陽性對照組DNA相比較，可定量檢測基因轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞;流式細(xì)胞分析技術(shù)(flow cytometiy)是借助流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定和分類的技術(shù)，利用偶聯(lián)不同熒光抗體標(biāo)記不同的細(xì)胞表面分子，再依據(jù)不同的細(xì)胞表面分子區(qū)分細(xì)胞亞群，或者通過分析細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)情況，評價細(xì)胞功能。

早期臨床試驗，主要利用反轉(zhuǎn)錄PCR法TCR基因掃描技術(shù)檢測TIL克隆或選擇抗原特異性T細(xì)胞。目前，MHC-肽四聚體染色法被越來越多用于檢測表達(dá)特定抗原表位的T細(xì)胞，抗原可以是高表達(dá)抗原、分化抗原、腫瘤-睪丸抗原和新抗原。一旦確定了T細(xì)胞的抗原表達(dá)信息，就可以利用反轉(zhuǎn)錄PCR法TCR基因掃描技術(shù)或MHC-肽四聚體染色技術(shù)分析回輸?shù)腡細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和存活時間。

在CAR-T和TCR-T臨床試驗中，主要利用實時熒光定量PCR和流式細(xì)胞分析技術(shù)定性和定量分析T細(xì)胞。大多數(shù)CAR-T臨床試驗利用熒光定量PCR技術(shù)檢測T細(xì)胞在外周血、腫瘤組織或骨髓中的存在情況。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測的優(yōu)點在于可同時檢測T細(xì)胞的多個參數(shù)，如可同時檢測CAR-T細(xì)胞上其他如分化、激活或耗竭相關(guān)表面分子的表達(dá)情況流式細(xì)胞儀和熒光定量PCR在檢測外周血中的CAR-T時具有同樣的敏感性。熒光定量PCR和流式細(xì)胞分析技術(shù)同樣用于TCR-T臨床試驗中相關(guān)免疫治療指標(biāo)的檢測。